Une nouvelle étape dans l’imagerie in vivo de la cornée

Cornée d'une souris, innervée par des nerfs sensoriels en provenance du cerveau. Cette image montre des extensions neuronales, ou axones, formant le vortex (la spirale) caractéristique. L'anti-βIII tubuline (magenta) marque l'ensemble des axones, et ceux impliqués spécifiquement dans le traitement de la douleur expriment la GFP (cyan). Elena Bizzarri et ses collègues ont utilisé la microscopie confocale à disque rotatif pour suivre la façon dont les axones individuels de la cornée se développent, arrivent à maturité et se remodèlent au fil du temps. 

Crédits: Quentin Rappeneau et Alain Chédotal

La cornée, interface essentielle entre l’environnement externe et les tissus oculaires internes, est un tissu étonnant. Cette fenêtre transparente, qui protège l’œil et amène la lumière vers le cristallin, n’est pas inerte, bien au contraire. La cornée est le tissu le plus innervé du corps humain, 300 à 400 fois plus que la peau. Cette densité nerveuse assure son maintien et facilite sa cicatrisation. Elle permet également le déclenchement de la sécrétion lacrymale et le réflexe de clignement des paupières, des éléments indispensables à la santé oculaire. Malgré leur importance, notre compréhension du développement, de la maturation et du remodelage des nerfs cornéens reste limitée.

Une configuration qui préserve l’animal

La majorité des études menées sur des modèles murins de maladies cornéennes reposent sur de larges cohortes de souris dont les échantillons sont prélevés ex vivo. Cependant, ces approches ne permettent pas de suivre l’évolution de chaque cornée au fil du temps chez un même animal ce qui complique l’interprétation des expériences, notamment pour tester l’effet d’agents pharmacologiques.  A l’inverse, l’imagerie in vivo permet d’étudier chez un même individu la réponse à un traitement ou une opération sur le long terme. Ce type d’imagerie permet d’améliorer l’interprétabilité des données, mais également de réduire de manière significative le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, conformément au principe des 3R (remplacer, réduire, raffiner). Jusqu’à aujourd’hui, l'imagerie in vivo des connexions nerveuses chez l’animal n’était pas assez rapide et précise pour suivre leurs modifications subtiles. Elle était également limitée à des durées relativement courtes, ne dépassant généralement pas quelques semaines. L’équipe d’Alain Chédotal a développé un protocole qui permet d’observer régulièrement les nerfs cornéens pendant des mois, et jusqu’à 2 ans soit la durée de vie d’une souris. Les chercheurs ont utilisé des souris transgéniques dont les nerfs cornéens expriment des protéines fluorescentes.

Pour réaliser l’imagerie, les chercheurs utilisent un microscope haute résolution de type spinning-disk. C’est un dispositif composé de deux disques lancés à plusieurs milliers de tours par minute. Le premier disque composé de microlentilles divise un faisceau lumineux incident en centaines de faisceaux secondaires, qui illuminent l’échantillon. En l’occurrence, il s’agit de souris transgéniques dont les nerfs cornéens expriment des protéines fluorescentes. Ces dernières réagissent aux faisceaux et émettent en réponse à leur tour une lumière, récupérée à travers les trous du second disque avant d’être détectée avec une caméra très sensible. Cette technique permet d’acquérir rapidement des images de haute précision avec peu de bruits (brouillage lumineux) et avec une puissance lumineuse suffisamment faible pour limiter la phototoxicité et les possibles échauffements engendrés par les faisceaux lasers. 

La lumière entrante est focalisée dans la cornée sans contact direct, grâce à des objectifs à immersion et un gel ophtalmique aqueux servant d’intermédiaire. Les réseaux nerveux peuvent ainsi être observés dans la cornée transparente sans avoir recours à des colorants externes ou à des interventions chirurgicales lourdes.

En permettant de suivre les mêmes souris tout au long de l’étude, plutôt que de comparer des animaux différents, les chercheurs peuvent réduire le nombre de souris nécessaires à leur projet, mais aussi effacer une partie des biais liés à la variabilité individuelle. Un groupe contrôle de souris imagées moins fréquemment a permis de confirmer l’innocuité de ce protocole.

Pour isoler des axones uniques dans le réseau dense fourni par le microscope, les chercheurs utilisent le logiciel de réalité virtuelle syGlass, permettant une segmentation manuelle précise en trois dimensions.

La cornée, un modèle prometteur

Grâce à ce système, Alain Chédotal et son équipe ont réalisé à ce jour la plus longue étude d’imagerie in vivo sur la dynamique neuronale d’un animal. Les chercheurs ont suivi et quantifié individuellement au fil du temps le devenir des nerfs, leur croissance, leur rétraction ou encore leur remaniement lors du développement postnatal et du vieillissement. Ils ont également suivi en temps réel la régénération axonale après une lésion de l’épithélium cornéen.

Leurs résultats indiquent que les axones en surface de la cornée se reconstruisent et se rétractent perpétuellement tout au long de la vie, contrairement aux profonds qui servent de cadre structurel stable. Au cours du temps, chaque trajectoire individuelle du réseau nerveux cornéen est unique avec cependant une tendance constante à la baisse de densité avec l’âge. La meilleure illustration de ce phénomène est le déplacement de l’organisation en spirale du réseau formé par les fibres nerveuses situées dans les couches les plus extérieures de la cornée.

Pourtant longtemps décrit comme un repère anatomique caractéristique, ce vortex apparaît ici comme une structure étonnamment instable, dont la position et la forme dérive au fil des mois, voire disparaissent.

Les chercheurs de l’Institut de la Vision ont ainsi développé une plateforme d’imagerie de haute résolution pour suivre l’évolution au cours du temps du réseau nerveux de la cornée. Cette technique qui est pensée pour la moins invasive possible leur permet de suivre le développement, la maintenance et la dégénérescence des axons de la cornée de rongeurs. Ces résultats constituent une base de référence pour comprendre les altérations de l’innervation cornéenne dans des pathologies telles que la chirurgie réfractive, le syndrome de l’œil sec, la kératite neurotrophique et les neuropathies sensorielles et la douleur cornéenne. Les nouvelles perspectives offertes par ce protocole font de la cornée, structure accessible à l’imagerie et densément innervée, un modèle particulièrement intéressant. Elle pourrait devenir un terrain d’étude privilégié pour étudier les mécanismes de la plasticité du système nerveux périphérique en réponses aux lésions, au vieillissement et aux interventions thérapeutiques, au-delà des pathologies oculaires.